【海外文献】使用臭氧化芦荟油通过增加斯普拉格·道利大鼠的PDGF和表皮厚度来治愈放射性皮炎
使用臭氧化芦荟油通过增加斯普拉格·道利大鼠的PDGF和表皮厚度
来治愈放射性皮炎
Widoasti Putri Utami1,Yan Wisnu Prajoko1,2,Christina Hari Nawangsih Prihharsanti1,3,UdadiSadhana1,4,Neni Susilaningsih1,5,Maryam Restiwijaya6,Muhammad Nur6
1 印度尼西亚三宝垄市迪博尼哥罗大学医学院生物医学科学硕士
2 印度尼西亚三宝垄市迪博尼哥罗大学医学院肿瘤外科学系；卡里亚迪博士中央总医院
3 印度尼西亚三宝垄市迪博尼哥罗大学医学院放射科学系；卡里亚迪博士中央总医院
4 印度尼西亚三宝垄市迪博尼哥罗大学医学院解剖病理学系；卡里亚迪博士中央总医院
5 印度尼西亚三宝垄市迪博尼哥罗大学医学院解剖组织学系；卡里亚迪博士中央总医院
6 印度尼西亚三宝垄市迪博内哥罗大学科学与数学学院物理系
摘要
长期使用皮质类固醇作为皮肤病（如放射性皮炎）的标准治疗方法，会引起许多副作用。作为选择，臭氧化芦荟油可以替代皮质类固醇，因为它的副作用较少，并且有利于伤口愈合过程。上皮再造和生长因子（如血小板衍生生长因子 (PDGF)）的形成在皮炎伤口愈合中起着重要作用。本研究旨在证明臭氧化芦荟油通过增加PDGF表达和表皮厚度来改善放射性皮炎伤口愈合的效果。本研究仅采用后测对照组设计。将36只斯普拉格·道利Sprague-Dawley大鼠分成6组（C1=未治疗，C2=2.5%氢化可的松软膏，P1=纯芦荟(AV)，P2=300mg/mL臭氧化芦荟(OAV)，P3=600mg/mL OAV，P4=1200mg/mL OAV。使用免疫组织化学染色的Allred评分评估PDGF的表达，而使用400倍显微镜放大倍数的苏木精和伊红(H&E)染色评估表皮厚度。使用Kruskal-Wallis检验(P=0.001)和单因素方差分析(P<0.001)发现对照组和治疗组之间的PDGF表达和表皮厚度存在显著差异。使用臭氧化芦荟油的组其平均PDGF表达和表皮厚度比其他组更高更厚。Spearman相关性检验显示两个变量之间存在很强的正相关关系（p<0.001和r=0.709）。总之，臭氧化芦荟油通过增加PDGF表达和表皮厚度来改善放射性皮炎伤口的愈合。
关键词：臭氧化芦荟；放射性皮炎；血小板衍生生长因子 (PDGF)；表皮厚度；生物医学；健康风险；延长预期寿命
重点：
1.本研究证明了臭氧化芦荟油对放射性皮炎伤口愈合的影响。
2.将未接受治疗的组与使用2.5%氢化可的松软膏和臭氧化芦荟治疗的组进行比较。
3.臭氧化芦荟油通过增加PDGF表达和表皮厚度来改善放射性皮炎伤口的愈合。
皮炎是最常见的皮肤病之一，其病因多种多样，其中之一就是辐射暴露（Paramata & Abas 2019、Prakoeswa etal.2021、Ginting et al. 2021）。电离辐射的副作用包括各种疾病，例如皮肤纤维化、皮肤细胞老化、皮肤细胞坏死以及引发表皮和真皮炎症反应（Singh et al. 2016、Robijns & Laubach 2018、Rosenthal et al. 2019）。辐射会导致并发症，例如伤口愈合延迟、美观度降低和生活质量下降。众所周知，接受放射治疗的癌症患者中约 95% 患有放射性皮炎（Spałek 2016、Wang et al. 2020）。放射性皮炎或放射性皮炎是促炎和促纤维化细胞因子失衡的结果。它减少了生长因子的数量，例如血小板衍生的生长因子 (PDGF)、表皮生长因子 (EFG)、转化生长因子-β (TGF-β) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) (Han et al. 2020, Vadarli & Angelo-Khattar2020)。
外用皮质类固醇是治疗各种皮肤病（其中一种是放射性皮炎）的标准药物（Gabros等人，2022年）。然而，长期使用外用皮质类固醇被发现对局部和全身都有副作用。在这个时代，许多替代药物已被开发出来，用作皮质类固醇的替代品，副作用最小（Coondoo等人，2014 年，Kumar等人，2019年）。芦荟是治疗各种皮肤病的替代品之一（Rao等人，2017年）。它的治愈特性与其所含的化合物葡甘露聚糖有关，葡甘露聚糖可以影响成纤维细胞生长因子，增加细胞活性和增殖，并刺激胶原蛋白的产生（Hashemi等人2015年，Vahlepi等人2020年，Tamba等人2020年）。
臭氧 (O3) 是一种经典的杀菌氧化剂，广泛应用于临床实践。臭氧具有抗菌、抗氧化、免疫调节、表观遗传修饰、生物合成、镇痛和血管扩张作用。局部制剂中的臭氧疗法可作为各种类型皮肤伤口治疗的补充或替代疗法 (Anzolin等人，2020年，Zeng等人，2020年)。
本研究不同于之前使用庆大霉素软膏作为对照，使用600、1200和1800 mg/mL 剂量的臭氧化芦荟油治疗全层伤口的研究 (Vahlepi等人，2020年)。本研究以300、600、1200 mg/mL剂量的臭氧化芦荟作为治疗组，以2.5%氢化可的松软膏作为阳性对照。臭氧化芦荟油治疗放射性皮炎的效果尚未得到广泛研究，而长期使用局部皮质类固醇有许多副作用。因此，本研究从 PDGF 表达和表皮厚度观察臭氧化芦荟油对放射性皮炎伤口愈合的影响。
材料与方法
01
本研究是一项实验研究，采用后测对照组设计，研究时间为2021年8月至9月。本研究中实验动物的使用符合印度尼西亚三宝垄市迪博尼格罗大学医学院卫生研究伦理委员会颁发的动物伦理批准号 66/EC/H/FK-UNDIP/VII/2021。所有用作实验动物的Sprague-Dawley大鼠均按照畜牧业标准进行治疗和护理。所有实验动物组均接受外部放射治疗。放射性皮炎治疗按治疗组区分。
实验动物研究对象为36只Sprague-Dawley 大鼠，随机分为6组（每组6只），包括两个对照组和四个治疗组。实验动物的纳入标准为雄性大鼠，年龄为2-3个月，体重为150±50克，来自三宝垄市苏丹阿贡大学实验动物实验室。大鼠在单独的笼子中适应一周，光照时间为12小时（06.00至18.00），黑暗时间为12小时（18.00至06.00），室温为28.0±2.0℃。大鼠的食物和水可随意取用。适应后，对大鼠进行外部放射治疗以产生放射性皮炎伤口。在这项研究中，辐射后，三只大鼠死于脱水。
放射性皮炎是通过用伽马射线照射大鼠背部4x4厘米的区域而产生的。所用的辐射剂量为单剂量7Gy，按照所用设备的计算，相当于5分钟。辐射是在印度尼西亚三宝垄市肯萨拉医院使用西门子Primus直线加速器放射治疗机（美国加利福尼亚州康科德）进行的。在辐射之前，通过腹膜内途径用80mg/kgBW氯胺酮（Ket-A-100，秘鲁）和10mg/kgBW赛拉嗪（Xyla，印度尼西亚）对大鼠进行麻醉。辐射后，在灯的帮助下将大鼠放在干净温暖的地方，直到它们从麻醉药的效果中恢复过来。
美国国家癌症研究所的《不良事件通用术语标准》（CTCAE 5.0版）将皮炎程度分为五个等级（美国国立卫生研究院-美国国家癌症研究所2017年）。在确定适当的治疗方法时，放射性皮炎的严重程度非常重要。
臭氧化芦荟油是在迪博尼格罗大学等离子研究实验室生产的。生产臭氧化油所用的工具是臭氧发生器和磁力搅拌器。将臭氧发生器产生的臭氧转入芦荟油中，从而获得臭氧化芦荟油。碘化钾滴定法用于测量臭氧化油中的臭氧水平。在本研究中，臭氧化芦荟的剂量为300、600和1200mg/mL。
在本研究中，通过比较正常皮肤组织和受辐射的皮肤，形成了放射性皮炎，其中受辐射皮肤的皮肤颜色、脱屑、PDGF表达量、TGFβ、表皮厚度等发生了变化。
在本研究中，实验动物发生了1级皮炎。Ran等（2004）通过研究指出，1-8Gy的伽马射线照射就能在大鼠身上造成放射性伤口。
每天两次将臭氧化芦荟油涂抹在放射性皮炎伤口上，每次薄薄地涂抹1.045毫升，覆盖整个伤口表面。先前的一项研究将剂量为8微升的多种臭氧化油涂抹在直径为3.5毫米的圆形伤口上（Valacchi等人，2011年）。在这项研究中，伤口直径为40毫米，因此所需剂量为313.478毫克/毫升、626.956毫克/毫升和1253.91毫克/毫升，相当于每次涂抹1.045毫升。干预持续七天，直到对实验动物进行显微镜和免疫组织化学评估。干预措施根据治疗组的划分进行，即C1=无治疗/干预（阴性对照）和C2=2.5%氢化可的松软膏（阳性对照），P1=芦荟油，P2=300mg/mL臭氧化芦荟(OAV)，P3=600mg/mL(OAV)，P4=1200mg/mL(OAV)。
各治疗组在第7天进行切除。将Sprague-Dawley大鼠置于封闭的房间内，然后吸入氯仿，即可进行伤口组织切除过程。切除范围是伤口组织最宽的部分以及周围健康的皮肤组织。切割组织的过程是使用切片机，将其放在纸上，并用10%缓冲福尔马林固定。随后进行免疫组织化学染色和苏木精-伊红染色。
将伤口组织切片（薄片）放入中性缓冲福尔马林溶液中固定18-24小时。用蒸馏水浸泡一小时去除组织固定剂。将组织切片浸泡在分级浓度的酒精中（80%、95%、95%、无水酒精I、II、III）各一小时，然后清洗。
将组织制剂放入石蜡中，在56-58℃的培养箱中放置两小时。使用切片机将石蜡中的组织切成3-6μm厚的薄片，然后漂浮在40℃的水中。将组织切片转移到显微镜载玻片上，在室温下干燥过夜，直到准备好进行苏木精-伊红染色和PDGF免疫组织化学染色。
PDGF表达评估
PDGF免疫组织化学染色在印度尼西亚苏拉卡尔塔的Sebelas Maret大学解剖病理学实验室进行。PDGF表达读数由迪博尼格罗大学的解剖病理学家进行。在免疫组织化学染色中，伤口组织中表达PDGF的细胞呈现棕色。使用Allred评分通过检查每100个染色细胞的百分比和染色强度对这些细胞进行半定量测量。然后，从400倍放大倍数的五个视野计算出每100个细胞/视野的平均值。
表皮厚度评估
表皮厚度测量由迪博尼格罗大学的解剖病理学家进行。使用放大倍数为400倍的尼康显微镜，在三个视野中测量表皮厚度（从角质层到基底层）。然后计算结果的平均值。表皮厚度以微米 (μm) 为单位计算，并使用Indomicro软件进行数字处理。
数据分析
数据分析（包括描述性分析和假设检验）使用SPSS21.0 程序进行。在描述性分析中，PDGF表达和表皮厚度以平均值和标准差 (SD) 表格的形式呈现。使用Shapiro-Wilk检验来检查数据的正态性。使用Kruskall Wallis检验来检查各组之间PDGF表达的差异。结果表明，数据不呈正态分布，因此继续进行事后Mann Whitney检验。由于数据呈正态分布，因此采用方差分析检验各组之间的表皮厚度差异。采用Spearman相关性检验进行变量间相关性检验。显著性限度为p≤0.05，置信区间为95%。
结果与讨论
02
PDGF 表达
表1显示了Sprague-Dawley大鼠皮炎皮肤切片中PDGF表达的免疫组织化学分析结果。
▼表1.基于Shapiro-Wilk检验的氢化可的松、纯芦荟和臭氧化芦荟油在放射性皮炎愈合中的数据正态性比较
▼表2.基于Kruskal Wallis检验的氢化可的松、纯芦荟和臭氧化芦荟油在放射性皮炎愈合过程中PDGF表达的差异
▼表3.基于事后Mann Whitney检验的氢化可的松、纯芦荟和臭氧化芦荟油对放射性皮炎愈合的重要性
这些结果表明，接受臭氧化芦荟油的组PDGF表达高于其他组。这些结果与之前的一项研究一致，即接受臭氧化油的组的伤口愈合和血管生成更好（Valacchi等人，2011年）。事实证明，给予臭氧化芦荟油对PDGF表达的影响优于2.5%氢化可的松软膏作为阳性对照。芦荟油中的臭氧可激活胶原蛋白合成和成纤维细胞增殖，有助于伤口愈合。
臭氧可以帮助组织适应氧化应激，刺激内源性抗氧化剂，防止组织损伤。多不饱和脂肪酸和真皮上层的少量水的反应会形成活性氧（ROS）和脂寡肽，包括H2O2，有助于伤口的愈合过程（Anzolin等人，2020年）。除此之外，成纤维细胞还影响内源性因子（如PDGF和TGF-β）的释放以及再上皮化过程。芦荟植物中的含量通过激活巨噬细胞来显示其对伤口愈合的影响。此外，臭氧化芦荟油可诱导伤口部位表皮角质形成细胞和真皮成纤维细胞表达PDGF和 TGF-β（Valacchi等人2011年，Hashemi等人2015年，Atik等人2019年，Zeng等人2020年，Vahlepi等人2020年，Tamba等人2020年）。PDGF会通过巨噬细胞传递信号，从而增加真皮和表皮的厚度，从而有助于加速伤口愈合过程 (Kim et al. 2009, Hashemi et al. 2015, Heldin et al.2018, Atik et al. 2019, Zeng et al. 2020, Vahlepi et al.2020, Tamba et al. 2020)。芦荟作为化学药物的副作用比氢化可的松少。氢化可的松有多种副作用，包括皮肤萎缩性改变、感染、眼部变化、药理副作用和其他非特异性副作用 (Hengge 2017, Williams 2018)。
▲图1. PDGF免疫组织化学染色结果。
表皮厚度
表4显示了使用H&E染色进行的组织学检查结果，显示了实验动物伤口组织切片的表皮厚度。
▼表4.表皮厚度描述数据和Shapiro-Wilk正态性检验结果
▼表5单因素方差分析结果
▼表6.事后最小显著性差异(LSD)检验结果
表5显示，接受1200mg/mL臭氧化芦荟油的组的平均表皮厚度最高。这可能是由于臭氧对生物体具有氧化杀灭作用。臭氧量越大，对伤口的反应越好。接受臭氧化芦荟油的P2、P3和P4组显示，上皮似乎比未接受任何治疗的组（阴性对照）、2.5%氢化可的松组（阳性对照）和芦荟组更厚。这与先前的研究一致，即臭氧化油比非臭氧化油更能刺激上皮再生（Valacchi 等人2011年，Kumar等人2019年，Tamba等人2020年）。
芦荟中的成分可以刺激细胞增殖，增加胶原蛋白的产生，影响成纤维细胞生长因子，增加角质形成细胞的增殖和迁移，因此可以帮助形成新表皮的过程。这种成分还起到增加DNA合成发生和刺激上皮生长因子受体与配体结合的作用，从而激活信号以增殖再上皮化（Kumar et al. 2019,Alfiaturrohmah et al. 2020, Tamba et al. 2020）。通过激活和增加代谢活性的过程，表皮生长因子（EGF）受体表达量会增加。伤口组织的表皮闭合会更活跃地发生，因此再上皮化过程更快（Hashemi et al. 2015, Alfiaturrohmah et al. 2020）。
臭氧暴露于伤口部位对伤口愈合过程的影响还体现在它能够减少细菌感染、改善皮肤伤口愈合障碍和增加氧张力 (Kim 等人，2009)。臭氧与多不饱和脂肪酸 (PUFA) 发生反应，通过激活氧化还原转录因子（如NFkB）形成活性氧物质(ROS)，如过氧化氢，从而诱导生长因子合成并加速细胞周期 (Kim等人，2009，Valacchi等人，2011)。
▲图2. Sprague-Dawley大鼠伤口组织H&E染色的表皮厚度
PDGF与表皮厚度相关性检验
进行相关性检验，确定PDGF表达与表皮厚度变量之间的关系。结果见表7和表8。
▼表7. PDGF表达与表皮厚度描述数据及Shapiro-Wilk正态性检验结果
Shapiro-Wilk正态性检验结果（表7）显示，PDGF表达数据呈正态分布（p>0.05）。上皮厚度数据不呈正态分布（p<0.05），因此进行了Spearman的Rho相关性检验。
▼表8. PDGF与表皮厚度的Spearmans Rho相关性检验结果
Spearmans Rho相关性检验显示p≤0.001，表明PDGF表达与表皮厚度之间存在显著相关性。本研究结果表明了强正相关的方向（表8）。
芦荟中所含的糖蛋白以及臭氧化芦荟油中的臭氧含量可刺激细胞增殖，增加表皮生长因子 (EGF)、血小板衍生生长因子 (PDGF)、成纤维细胞生长因子 (FBF) 和其他刺激上皮形成的生长因子的表达 (Hashemi等人2015年，Atik等人2019年)。PDGF会诱导成纤维细胞和角质形成细胞的增殖和迁移，从而通过增加真皮和表皮的厚度来影响伤口愈合过程 (Jacobson等人2017年)。这表明角质形成细胞增殖的发生可能根据生长因子的数量和类型而增加或减少，因此PDGF的产生会导致更多的增殖，从而加速上皮化过程 (Kim等人2009年，Valacchi等人2011年)。
优势和局限性
本研究的局限性在于所使用的设备和高成本，因此辐射束仅施用一次（单剂量）。此外，免疫组织化学检查的成本相对较高。预计本研究将用作相对较高的成本。本研究有望作为根据循证医学对臭氧化芦荟产品进行人体伤口愈合治疗的临床试验的基础。
结论
03
放射性皮炎，是由于辐射暴露导致皮肤损伤而发生的。臭氧化芦荟可以改善PDGF表达和表皮厚度。使用H&E染色评估PDGF表达和表皮厚度的免疫组织化学和组织学检查表明，局部臭氧化芦荟油可以增加放射性皮炎伤口愈合过程中的PDGF表达和表皮厚度。局部使用臭氧化芦荟油的放射性皮炎伤口愈合效果优于不进行任何治疗和局部使用2.5%氢化可的松。
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【免责声明】本文文献来源于Folia Medica Indonesiana《印尼药用植物》（2022年12月第58卷第4期）、部分图片来源于网络，版权归原作者所有，仅供学术交流用，如有侵权，请联系我们删除。
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